一、原理

呋喃代謝物四合一ELISA檢測試劑盒組織蜂蜜版采用間接競爭ELISA方法定量檢測樣品中呋喃代謝物的殘留量。

二、適用范圍

定量檢測組織、蜂蜜樣品中呋喃代謝物的殘留。

三、呋喃代謝物四合一ELISA檢測試劑盒組織蜂蜜版特點及技術(shù)指標(biāo)

* 檢 測 時 間 ：40min-70min

* 試劑盒檢測純陰性樣本的背景值＜0.05 ppb；

試劑盒檢測樣本的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性：

四、所需材料

儀器：微孔板酶標(biāo)儀450 nm/630 nm、均質(zhì)器、振蕩器、氮吹儀、離心機、刻度移液管（10 mL）、天平（感量0.01 g）、離心管（5 mL, 50 mL）

微量移液器：10 µL～100µL、100 µL～1000µL

試劑：乙酸乙酯、去離子水、 濃鹽酸 、氫氧化鈉

五、 試劑盒組成

注*：標(biāo)準(zhǔn)品A、B、C、D、E

呋喃它酮標(biāo)準(zhǔn)品：0,0.05,0.15,0.45,1.35ppb；

呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品：0,0.1,0.3,0.9,2.7ppb；

呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)品：0,0.1,0.3,0.9,2.7ppb；

呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)品：0,0.1,0.3,0.9,2.7ppb；A、B標(biāo)準(zhǔn)品各1mL，其余各0.5mL，直接使用。

六、溶液配制

配液1: 洗滌工作液

   用去離子水將20×濃縮洗滌液按1 : 19體積   比進行稀釋，用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月，用前一天取出回溫。

配液2:  1×呋喃樣品稀釋液     

   用去離子水將2×呋喃樣品稀釋液  按1:1體積比進行稀釋，用于樣本的稀釋，配好后在4℃環(huán)境可保存六個月，用前一天取出回溫。

配液3:  0.1 M HCl

   量取860 μL濃鹽酸加去離子水/雙蒸水混勻定容至100 mL，濃鹽酸揮發(fā)在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。

配液4:  0.1 M NaOH

    稱取0.4g 氫氧化鈉加去離子水溶解定容至100ml。

七、樣本前處理                                                   

樣本處理前須知：

① 處理完的樣品應(yīng)及時進行下步檢測，實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

② 樣本數(shù)目超過8個時推薦使用排槍加樣。

動物組織、蜂蜜 （稀釋倍數(shù)：2）

  ① 稱取2.0±0.05g均質(zhì)后的樣本，加入8ml

  0.1 M HCl 和400μL 呋喃衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩1min；

    ② 置于37 ℃過夜孵育（大約16h）；

③ 分別加入8 ml 0.1 M NaOH和20ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s；

④ 4000r/min，室溫（20～25℃/68-77℉）離心5min；

⑤ 取上層10ml乙酸乙酯相至離心管中，于50～60℃氮氣流下吹干；

⑥ 加入1.6 ml 1×呋喃樣品稀釋液（動物組織、蜂蜜），用渦旋儀渦動60s使干燥物溶解，用于分析。

八、 酶標(biāo)免疫測定程序

• 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，待其*回  升至室溫（20～25℃）后方可使用。注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
•  按標(biāo)準(zhǔn)品和樣品雙孔平行的數(shù)量使用微孔。
•  按下列方式點板：

  呋喃唑酮、呋喃西林：

（1）加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品、酶、抗體：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µL 到對應(yīng)的微孔中，加入呋喃酶標(biāo)物50µL /孔， 再加入呋喃唑酮/呋喃西林抗體50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。

（2）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250 µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

（3）顯色：加入底物液A液50 µL/孔，再加底物液B液50 µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)10min。

（4）測定：加入終止液50µL/孔，用酶標(biāo)儀立即  測定雙波長450/630nm吸光度值。

呋喃它酮、呋喃妥因：

（1）加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品、抗體：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品100µL

到對應(yīng)的微孔中，再加入呋喃它酮/妥因抗體50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃反應(yīng)30min。

（2）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

（3）加酶標(biāo)物100µL/孔，用蓋板膜蓋板后置37℃反應(yīng)30min。

（4）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

（5）顯色：加入底物液A液50µL/孔，再加底物    

液B液50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃反應(yīng)10min。

（6）測定：加入終止液50µL/孔，用酶標(biāo)儀立即測定450nm處的吸光度值（建議用雙波長450/630nm）檢測。

九、 結(jié)果判定

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃實際濃度。（詳見試劑盒專業(yè)分析軟件，以便進行大量樣本的分析計算。）

十、 注意事項

① 洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

② 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

③ 不使用過了有效期的試劑盒，不交換使用不同批號的試劑。

④ 0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質(zhì)。

⑤ 在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時間為15min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到20-30min，反之則減短反應(yīng)時間。

⑥ 未提及樣本請致電本公司技術(shù)服務(wù)部。

十一、貯藏條件及保存期

    貯藏條件： 2～8℃

保 質(zhì) 期： 12個月

十二、問題與對策